Влияние ударных волн на отложение Ca + + в остеобластах человека in vitro.

07.12.2021

Влияние ударных волн на отложение Ca + + в остеобластах человека in vitro.

Низкий уровень отложения Са + +, индуцированного лечением SW, может быть связан с уменьшением активности ферментов, с минерализацией костной ткани, такими как активность ALP, а также измениями Са + + внутри- и внеклеточных потоков.

С. Russol *, Л. Vallefuoco2, M. D'Anna2, Г. Suzuki3, А. Ciampa 3, Е. Marl inghaus 4, Е. М. Corra do1, С. Montagnani 2

1.    Ортопедическая клиника кафедры хирургической и ортопедических наук.

2.    DEPT. из Биоморфологических и функциональных наук, медицинский факультет, «Федерико II" Университет Неаполя

3.    Кафедра Морфологических и биомедицинских наук Университета Вероны

4.    Оборудование предоставил научно-исследовательский центр, Storz Medical AG, Kreuzlingen, Швейцария

Предпосылки.

Методика

In vitro культивированные человеческие остеобласты были получены из хирургических фрагментов. Так же были представлены три SW аппарата. Отложение Ca + +, активность ALP и NOS, клеточные темпы роста и дифференцировки были оценены и сопоставлены с данными, связанными с контрольной группой клеток.

Результаты

Лечение может ингибировать как темпы роста, так и отложения Ca + +. В то же время SW изменяет активность NO-синтазы (NOS) человеческих остеобластов, поэтому предположительно влияет на активность ALP.

Интерпретация

Низкий уровень отложения Са + +, индуцированного лечением SW, может быть связан с уменьшением активности ферментов, с минерализацией костной ткани, такими как активность ALP, а также измениями Са + + внутри- и внеклеточных потоков.

Использование ударной волны (Shock Wave) к клиническому применению ортопедических болезней было рассмотрено с особым вниманием (Haupt G, 1997). Наш интерес был вызван некоторыми заболеваниями костей и сухожилий, такими отклонениями как кальцификация intratendineous, которые восстанавливаются в нормальных условиях после обработки SW.

SW является временным нарушением давления, которое распространяется быстро в трехмерном пространстве, это связано с резким ростом от атмосферного давления до максимального давления и кавитации из-за негативной фазы волн (Ogden JA и др., 2001). Различные авторы изучали влияние SW на нормальных и патологических клетках (Смите Г.А. и др., 1991), а в последнее время было показано, что эта физическая стимуляция вызывает кратковременное повышение проницаемости клеточных мембран. На самом деле это приводит к образованию ямочки на клеточной мембране и гиперполяризации мембранного потенциала (Martini L и соавт. 2005). Исследования в естественных условиях и in vitro показали, что механическое раздражение связано с физиологическими изменениями в костных клетках (WangFS и соавт., 2003). Ответ на механические раздражители в костных клетках связан с увеличением открытия ионного канала, потенциальными изменениями в мембранах, в пролиферации клеток и синтезе белков деятельности, связанной с регулированием формирования костей и костной ткани (Хартер LVET др.. 1995).

Так биологический эффект этих устройств, производимый на Ca + + клеточный метаболизм, тем не менее совершенно неизвестен, наше исследование было сосредоточено на морфологии, распространения и ферментативной деятельности, связанной с минерализацией, как щелочной фосфатазы (ALP), в пробирке культивированных человеческих остеобластов. В естественных условиях лечение SW, очевидно, очень отличается от нашей экспериментальной системы, как биологические структуры, таких тканей как мышцы, суставы, сухожилия и т.д., создают биологический фильтр между источником SW и клетками, которые являются конечной целью лечения. Это не произойдет в пробирке, где SW действует непосредственно на клеточной популяции.

Методы, материалы и клеточные культуры

Хирургическое образцы костной ткани были получены из молодых пациентов (8 мужчин в диапазоне 18-24 лет) при травматических повреждениях. Они промыты антибиотиком нафизрастворе, представлены микродиссекции, как механически под микроскопом, так ферментативно, под коллагеназой (коллагеназа IV-S8 Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) 40 'при 37 ° C, и, наконец, высеены в культуру блюд и культивированы в MEM a-среда с 10% FBS, L-glutammine 20 мм, P / S 1%, витамина С 50gg/ml и fungyzone 0,2%. Клетки культивировали в увлажненном воздухе 95% / 5% CO2 инкубатор, при температуре 37 ° C. Когда клетки мигрировали из микрофрагментов ткани в посуду культуры, после 3-4 недель, мы добавили 1-2ng/ml основной FGF (FGF б, Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) и Desamethasone 10-8 M и Р-глицерин- фосфат 2mg/ml (Sigma, Сент-Луис, штат Миссури США) в среду, чтобы вызвать дифференциацию остеобластов и минерализацию костного матрикса.

Лечение с помощью ударных волн.

Пролиферация клеток

Клетки были отделены с помощью 0,25% трипсина в ЭДТА и клеточную пролиферацию оценивали с Neubauer, гемоцитометром, на 2, 4 и 7 дней культуры. Скорость роста клеток изучалась в ходе лечения, то есть между приложением и следующей процедурой, а затем в конце лечения.
1)    активность щелочной фосфатазы

Согласно протоколу, предложенному Sigma Aldrich (Sigma Diagnostics, Сент-Луис, штат Миссури, США) фиксированные клетки инкубировали при комнатной температуре 18-26 ° С в растворе, содержащем нафтол AS-BI-фосфат и недавно подготовленным Fast Red LB Фиолетовая соль или соль Быстрый Синий, BB буфером при рН 9,5 с 2-амино-2-метил 1,3-пропандиол (AMPD).Показателем деятельности являются красный или синий, в зависимости от выбора солей диазония.

2)    измерение щелочной фосфатазы

Щелочную фосфатазу (ALP) определяли с помощью р-нитрофенилфосфата, в качестве субстрата (Sigma). Клетки соскабливались на 500 мкл сборного ледяного буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 0,2% NP-40 и 2 мм фенилметилсульфонилфторида, PMSF,) (Sigma). Enzimatic активность измерялась с помощью автоматического анализатора (Hitachi 747, Boheringer Mannheim, Индианаполис, Индиана, США). Результаты выражали в виде UI / (активность ферментов) / 104 клеток.

3)    анализ nNOS


Для статистической оценки нашим данным на пролиферацию клеток мы использовали Т-критерий Стьюдента для непарных данных; значение вероятности р <0,05 было принято статистически значимым.

Результаты пролиферации клеток

Пролиферация клеток в 2, 4 и 7 дней после посева и во время лечения представлены в табл. 2, очевидно, шаги были статистически значимыми. Клеточный рост снизился в группе, которая была представлена после сильного лечения, в то время как снижение распространения было меньше, чем для более легкого лечения, как темпы роста, указанные в группе C.


Таб. 2 распространение остеобластов во время лечения SW


Ферментативная активность

1)    Активность щелочной фосфатазы-ALP, очевидно реакция окрашивания была проведена после 4 дней в пробирке в нашей культуре. Это пятно было выполнено как в базальных условиях, чтобы подтвердить, что наши клетки были дифференцированными остеобластами и после лечения. Ферментативная активность хорошо прослеживается во всех блюдах с клетками, во время проверки в световом микроскопе, но морфология клеток, а также их количество, действительно разные. В частности, лечение SW может изменять формы клеток, которые после ALP окрашивания, кажутся более плоским, и немного уменьшаются во всех группах лечения (рис. 1) Рис.1 ALP окрашивание in vitro культивированных человеческих остеобластов. SWлечение изменяет морфологию клеток и уменьшает ферментативную активность ALP (А) Контрольная группа, (B) группа E. Увеличение 130X
Tab. 3 ALP активности в человеческих остеобластов во время лечения SW.

SW индуцированные изменения в деятельности NOS представлены в табл.

4. Существует резкое повышение активности nNOS в ячейке группы B, по сравнению с контрольной группой, в то время как значение этого типа NOS снизилась в группе А. iNOS увеличилось, очевидно в связи с увеличением мощности лечения.



Tab. 4 Эффект влияния SW на активность NOS

Мы использовали отложения Ca + + .

Са + + показал, коричневатые выделения в минерализованной матрице, в качестве доказательства клеточной дифференцировки.

Пятно было выполнено через 7 и

12 дней после обработки с SW. Ca + + коричневатого осадка минерализованной матрицы всегда раньше проявляется в контрольных клетках; в в культурах клеток, минерализованных ECM, , обработанных SW, появился, только через 7 дней. Количество осадка Ca + + было менее очевидным, чем в необработанных клетках. Пятно, выполненное через 12 дней после лечения, показало убедительные доказательства минерализации для всех групп клеток, но подтвердило, снижение уровня отложения Ca + + в клетках, представленных после лечения SW^to. 2).

Рис. 2 отложение Ca + + в пробирке уменьшается на фоне лечения SW, также в присутствии дексаметазона и Р-глицерофосфата.



Слева образец из контрольной группы, справа от SW, рассматриваем группу B. Данные относятся к 7 (AB) и 12 (CD) дней культуры после лечения SW. Фон Косса, увеличение 450X матрицы. Этот метод позволяет оценить некоторые морфологические и физиологические аспекты клеток, такие как темпы роста, Н.У.К. активность и экспрессию маркеров костной дифференциации, как ALP деятельности и Ca + + отложений.


Недавно было показано, что SW приводит к увеличению активности eNOS и не образуется и в других экспериментальных системах (Мариотто S и соавт. 2005) В то время, как присутствие nNOS в человеческих остеобластах еще не общепринятое утверждение (MacPherson H и соавт. 1999) . В результате, уровень nNOS является очень низким в человеческих остеобластах, при культивировании в лабораторных условиях, но он быстро увеличивается на низких уровнях энергии в нашей экспериментальной системе. Наши результаты подтверждают, что SW способствует быстрому увеличению NO производства за счет повышения каталитической активности nNOS, с максимальным значением (около 10 складок под контролем значений) было достигнуто на среднем уровне плотности энергии. С другой стороны, наблюдаемое снижение eNOS могло бы способствовать подавлению активности щелочной фосфатазы и отложения Ca + + в минерализационной матрице. Недавно было продемонстрировано заметное замедление, как в послеродовом формировании костей, так в созревании остеобластов у мышей eNOS нокаутом, в результате уменьшения объема кости (Aguirre Jи соавт., 2001).

Все вместе, эти результаты способствуют выяснению причин, почему SW лечение является полезным инструментом для уменьшения отложений Ca + + , как они действуют замедляя минерализацию Дополнительной костной клеточной Матрицы in vitro культурного слоя остеобластов, а также они делают в атипично локализованных кальцинированных участках тканей, в естественных условиях. Что касается различных уровней энергии, которую мы использовали, по нашему мнению, средне-низкий уровень предпочитают для исследования биологических эффектов SW; сильные уровни (как группы) могут вызвать повреждение клеток, в то время как слишком низкое приложений (группа C) может быть практически неотличимы от контрольной группы. Поэтому мы решили показать главным образом наши данные о группе B и группе Е. Интересно, что некоторые свидетельства показывают, что SW на более высоких уровнях энергии, индуцированного увеличением производства NO, может оказать положительное влияние на дифференцировку мезенхимальных клеток к остеопрогенерации (Wang FS и соавт., 2002). Это не согласуется с нашими данными, как это хорошо известно, что SW являются полезными в процессах регенерации, в естественных условиях: они могли действовать вызывая дифференциацию проживающих или циркулирующих мезенхимальных клеток. Напротив, мы использовали более низкие энергии, и только хорошо дифференцированные остеобласты, наблюдались различные эффекты SW. Это может означать, что мы можем модулировать ее последствия путем изменения ее энергетических уровней.


Sergio Russo

Клиника ортопедии кафедры хирургических и ортопедических Наук, медицинский факультет, университета «Федерико II»,

Via Pansini 5, I - 80131 Неаполь










Теги: ударные волны
234567 Начало активности (дата): 07.12.2021 16:10:00
234567 Кем создан (ID): 989
234567 Ключевые слова:  ударные волны, Сa, остеобласти, ферменты, минерализация кости
12354567899