Несмотря на совершенствование оперативной техники, лечение крупных костных дефектов, вызванных травмой, метастатическим повреждением или инфекционным процессом, по-прежнему остается большой проблемой для травматологов-ортопедов [1, 2]. Такие повреждения приводят к замедленной консолидации или несращению переломов, что, в конечном итоге, нарушает опорно-двигательную функцию пациента [3, 4]. В настоящее время для лечения данного состояния наиболее часто применяется трансплантация костной ткани [5, 6]. Однако ограниченность источников донорской ткани, осложнения и трудность забора трансплантата, риск передачи инфекционных заболеваний, краткосрочная жизнеспособность и непредсказуемая резорбция трансплантата лимитируют широкое применение данной методики и требуют разработки новых подходов к лечению данной патологии [7, 8].

Применение современных регенеративных методик, в частности тканеинженерных, представляет собой многообещающий подход к терапии костных дефектов и привлекает внимание большого количества исследователей в последние годы [4, 9]. Так, например, использование клеточных технологий позволит преодолеть часто встречающуюся у пожилых пациентов остеогенную «недостаточность», при которой собственные ресурсы организма не способны восстановить утраченную костную ткань [10-12].

Ангиогенный эффект экзосом приводит к улучшению кровоснабжения образующейся костной ткани, оптимизировав, тем самым, процесс остеогенеза [13-15].

При подготовке обзора использованы электронная база данных научной литературы Pubmed и электронная библиотека e-Library. Поиск литературных данных произведен по ключевым словам: регенеративная медицина/regenerative medicine, костные дефекты/bone defects, экзосомы/exosomes, мезенхимальные столовые клетки/mesenchymal stem cells.

 Использованы следующие критерии включения: обзорные статьи, систематические обзоры, мета-анализы, многоцентровые исследования, контролируемые когортные исследования, неконтролируемые когортные исследования. Критериями исключения являлись статьи без полнотекстовой версии, дублирующие статьи. Предпочтение отдавалось работам за последние пять лет.

Способы стимуляции костной регенерации

Тканевая инженерия представляет собой междисциплинарную область, направленную на разработку новых биологических подходов в терапии широкого спектра заболеваний [12]. Потребность в тканеинженерных методиках в регенерации кости обусловлена ограниченными способностями человеческого организма к корректной ауторегенерации, особенно у коморбидных и пожилых пациентов с остеопорозом [10]. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) играют значительную роль в процессе ремоделирования костной ткани, поскольку являются предшественниками ключевых регуляторов данного процесса остеобластов и остеокластов, а также способны мигрировать в зону дефекта [16]. 

Благодаря значительным достижениям в изучении биологии стволовых клеток стали возможными новые терапевтические регенеративные стратегии, исключающие использование аутологичной костной ткани [17].

Нехватка тканевых трансплантатов также стимулировала развитие технологий регенеративной медицины с использованием природных биоматериалов, обладающих такими положительными свойствами как биосовместимость, биоактивность, регулируемая деградация и структурное сходство с нативными тканями внеклеточного матрикса [18]. Одной из философий развивающейся регенеративной медицины является создание таких биоматериалов-скаффолдов, одновременно имитирующих внеклеточный матрикс и положительно модулирующих активность собственных/экзогенных стволовых

На данный момент для улучшения костной регенерации используются [10]:

 

   Тканевые трансплантаты:

 

  -  аутологичного происхождения (костные трансплантаты, губчатые трансплантаты);

 

 -   аллогенного происхождения (костные трансплантаты, костно-трансплантатный продукт).

    Компоненты внеклеточного матрикса:

  

  коллаген (1, 2 и 4 типов);

-   фибронектин;

 

-   ламинин.

  

-  деминерализированный костный матрикс;

 

-  децеллюлюляризованный костный внеклеточный матрикс;

  

 -  кальцинированная бычья кость.

 

 -   Ex vivo-культивируемые терапевтические клетки:

 

 -   трансплантация МСК;

 

 -   внеклеточный матрикс, сформированный клетками;

  

 -   экзосомы.

Особый интерес исследователей сосредоточен на использовании мезенхимальных стволовых клеток и внеклеточных везикул в качестве стратегий оптимизации регенерации костной ткани [4].

Мезенхимальные столовые клетки

В настоящее время существуют две основные стратегии использования МСК с целью улучшения регенерации костной ткани: высвобождение-мобилизация эндогенных МСК и применение экзогенных стволовых клеток [20]. 

Использование экзогенных столовых клеток возможно несколькими путями: системное введение путем внутривенной инфузии [21] и местное применение клеточных суспензий, пластов и сфероидов [22]. При системном применении МСК помимо остеогенного эффекта демонстрируется и модуляция иммунного статуса, а соответственно, и восстановление микросреды, однако процент клеток, достигших костного дефекта, остается низким, что влияет на терапевтическую эффективность [21, 23]. Применение клеточных пластов [24] и сфероидов [25] с образованным стволовыми клетками внеклеточным матриксом способствует высвобождению большого количества факторов роста и цитокинов, улучшающих регенерацию костной ткани, что успешно используется в лечении костных дефектов [26] и для улучшения связи кость-трансплантат [27]. Так, в исследовании А.А. Вишневского и др. [28] показано, что добавление МСК к костным трансплантатам на модели дефекта реберного каркаса кроликов способствует увеличению доли зрелого костного матрикса и более интенсивной

В последние годы большое внимание уделяется и микроокружению клеток, так как обнаружено его существенное влияние на функциональную активность столовых клеток и их воспроизводимые терапевтические эффекты [6]. В патологической микросреде жизнеспособность и дифференцировка МСК снижается. Таким образом, при цитотерапии значительную роль в определении терапевтической эффективности трансплантированных стволовых клеток играют как микросреда донора, так и микросреда реципиента [29]. К важным системным факторам, влияющим на регенерацию костей и микроокружение клеток, относятся уровень стероидных гормонов [30] и глюкозы крови [31], а также активность воспалительного процесса [32]. Показано, что снижение уровня эстрогена у женщин в постменопаузе приводит к ухудшению пролиферации и остеогенной дифференцировки МСК костного мозга (КМ),  снижению минерализации костной ткани, накоплению активных форм кислорода, адипогенной дифференцировке клеток, дисбалансу между остеобластогенезом и остеокластогенезом и, в конечном итоге, к потере костной массы [33].

 Повышенный уровень кортикостероидов также подавляет пролиферацию и остеогенный потенциал МСК КМ [34]. На клеточном уровне энергетический метаболический профиль оказывает существенное влияние на функции стволовых клеток, так повышенная концентрация глюкозы вызывает дисфункцию МСК КМ [35]. Окислительный стресс и накопление конечных продуктов гликозилирования приводят к снижению жизнеспособности и остеогенной дифференцировки столовых клеток [36]. Несмотря на существенную роль воспаления в процессе заживления костной ткани, провоспалительная микросреда является ключевым патогенетическим механизмом, лежащим в основе различных остеопенических расстройств, так как воспалительные цитокины приводят к ухудшению пролиферации и остеогенной дифференцировки, избыточному производству активных форм кислорода и апоптозу столовых клеток [31]. Таким образом, для улучшения регенеративного потенциала стволовых клеток следует производить анализ и корректировку уровня стероидных гормонов и глюкозы как у донора, так и у реципиента, а также модулировать воспалительную микросреду [36].

Для этого в клинике могут использоваться регуляторы экспрессии генов, такие как рапамицин, сигнальный ингибитор mTOR [37]; DAPT, сигнальный ингибитор Notch [38]; PDTC, сигнальный ингибитор ядерного транскрипционного фактора-kappaB (NF-kB) [39]; GSK2606414, ингибитор PERK [40]; антиоксидант NAC [41]; ликохалкон А [42] и др. 

Продемонстрированная ими эффективность говорит о потенциальном применении методики нормализации микроокружения столовых клеток с целью повышения эффективности МСК-опосредованного заживления костей [43].

На данный момент все более привлекательным для клинических специалистов становится использование именно МСК жировой ткани (ADSC), как наименее травматичного для пациента метода [44]. Однако ограниченный потенциал ADSC к остеогенной дифференцировке и естественная тенденция к адипогенной дифференцировке препятствуют их широкому применению в регенерации костной ткани [45].

При этом из данных литературы известно, что кольцевые РНК (circRNA) играют существенную роль в определении дальнейшего пути развития столовых клеток и клеток-предшественниц [46]. В своем исследовании D. Zhang et al. [44] оценивали модулирующее влияние circRNA на остеогенную дифференцировку столовых клеток жировой ткани. CircRNA представляет собой замкнутое непрерывное кольцо РНК, что делает ее более стабильной по сравнению с линейной РНК ввиду отсутствия свободного конца, доступного для ферментной деградации [47]. Некоторые эффекты circRNA воспроизводятся путем воздействия на микроРНК (miR), регулирующих экспрессию генов-мишеней [48]. Так, в ходе данной работы выяснено, что circRNA-vgll3 напрямую связывается с miR-326-5p в цитоплазме клеток по типу «губки» и ингибирует ее активность, что приводит к увеличению экспрессии интегрина а5 (Itga5) [44].

Известно, что Itga5 играет существенную роль в адгезии клеток к внеклеточному матриксу, улучшает функциональную активность и выживаемость остеопрогениторов, а также осуществляет некоторые механизмы остеогенных факторов роста, таких как BMP2, TGFp и PTH [49]. Увеличение экспрессии Itga5 по circRNA-vgll3/miR-326-5p/integrin а5 сигнальному пути приводит к улучшению самонаведения ADSC, рекрутированию остеопрогениторных клеток и улучшению остеогенной дифференцировки стволовых клеток жировой ткани [44]. При использовании ингибитора circRNA-vgll3 снижается экспрессия мРНК генов остеогенной дифференцировки ADSC (Runx2, OSX, Col1a1, OPN, OCN и BSP) [44].

Также оценен терапевтический эффект совместного применения drcRNA-vgП3-модифицированных скаффолдов из фосфата кальция и ADSC на модели костного дефекта черепа крыс, выявлено повышение минеральной плотности и увеличение объема новообразованной костной ткани по сравнению с группой контроля [44]. Результаты данного исследования показывают перспективность использования кольцевых РНК, а именно circRNA-vgll3, для улучшения остеогенной дифференцировки столовых клеток жировой ткани и их дальнейшего применения при восстановлении костных дефектов [44].

Литературные данные об исследовании эффективности стволовых клеток в восстановлении костной ткани не ограничиваются одними лишь испытаниями на животных. Так, В.Н. Бордаков и др. [50] представили данные об успешном применении в своей клинической практике тканеинженерных конструкций на основе гидроксиапатита кальция, фибринового клея и МСК костного мозга в лечении пациентов с дефектами длинных трубчатых костей. При гистологической оценке регенерата через 1 месяц после трансплантации ими была обнаружена формирующаяся костная ткань, а результатом лечения стали последующая консолидация перелома и восстановление функции. 

Однако авторы подчеркивают важность дальнейшего изучения данной комбинации биологически активных компонентов в последующих исследованиях [50].

Экзосомы

Традиционная тканевая инженерия основана на применении скаффолдов, культивируемых клеток и факторов роста [51]. При этом использование клеток имеет ряд недостатков: ограниченность источников, недостаточная активность клеток, иммунологические реакции и высокие затраты на клиническое применение [52]. В то же время терапевтический потенциал экзосом аналогичен паракринным функциям столовых клеток и преодолевает ограничения, связанные с их трансплантацией [1]. Именно поэтому более безопасная бесклеточная тканевая инженерия может стать альтернативой клеточной терапии [2, 53, 54]. Так, в исследованиях регенераторного потенциала экзосом МСК на модели костного дефекта крыс, выполненного И.В. Майбородиным и др. [55, 56], продемонстрировано более быстрое заживление и увеличение плотности костной ткани, а также формирование менее грубой костной мозоли по сравнению с группой контроля.

Моноциты и макрофаги, как известно, являются ключевыми регуляторами процессов заживления тканей, при этом различные фенотипы макрофагов по-разному влияют на процессы восстановления [57]. В процессе репарации происходит рекрутирование моноцитарных макрофагов, переход от Mj-фенотипа, провоспалительного, к Mj-фенотипу, противовоспалительному [58]. Современные исследования сосредоточены на изучении влияния различных фенотипов макрофагов на регенерацию тканей [59]. Так F. Loi et al. [60] предположили, что последовательное изменение фенотипов макрофагов вносит существенный вклад в процесс остеогенеза. Макрофаги контролируют физиологический процесс восстановления кости путем секреции различных факторов, остеоиндуктивных и, наоборот, ингибирующих костную регенерацию [61]. Межклеточные взаимодействия опосредуются выделением в локальную среду экзосом (Exos) - внеклеточных везикул размерами от 40 до 150 нм, содержащих в своем составе белки, липиды и нуклеиновые кислоты, в том числе miR [62, 63]. Экзосомы, захваченные клетками-мишенями, оказывают на них биологическое воздействие, изменяют их модель поведения и активируют сигнальные пути [64]. В исследовании M. Kang et al. [59] исследована функциональная роль паракринных факторов - Exos M0, Mj и Mj-макрофагов - в лечении экспериментальных животных с дефектами критического размера на модели дефекта кальвария крыс. Выявлено, что Exos M0 и М2-макрофагов способствуют восстановлению костей, а Exos M1 негативно влияют на костную регенерацию [59]. Exos Mp а именно miR-155, негативно влияют на RUNX2 и BMP сигнальные пути, в частности BMP2 и BMP9, результатом чего является снижение остеогенной дифференцировки МСК, в то время как Exos M0 и M2, miR 378a, способствуют экспрессии остеоиндуктивных генов МСК [59]. КТ-оценка, проведенная через 3 недели, показала ухудшение образования кости в группе Exos M1 и улучшение - в группе Exos M0 и М2-макрофагов [59]. В других исследованиях продемонстрировано, что в результате совместной культивации М2-макрофагов с остеопрогениторами улучшился остеогенез, а Ml-макрофаги снизили экспрессию остеогенных маркеров и ухудшили минерализацию костной ткани [65, 66]. Данное исследование подтверждает результаты других работ и свидетельствует о дифференциальном и противоположном влиянии поляризованных макрофагов и их экзосом на регенерацию костной ткани, а также дает основание о перспективности использовании экзосом М0 и М2-макрофагов в качестве стимуляторов остеогенеза [67-69].

Патогенетически важный противовоспалительный эффект экзосом продемонстрирован в исследовании X. Wang et al. [70], которые изучали влияние скаффолда из поликапролоктона (PCL) в сочетании с экзосомами МСК и S-нитрозоглутатионом (GSNO) на восстановление костной ткани. PCL является биосовместимым, но биоинертным полимером, что ограничивает его самостоятельное применение в костной инженерии [71]. В то время как GSNO, являющийся донором NO, регулирует активность свертывающей системы крови, оказывает противовоспалительное действие и препятствует деструкции костной ткани [72]. В ходе работы выявлено уменьшение экспрессии провоспалительных генов (IL-6, TNF -a, iNOS и Il-ip), улучшение остеогенной дифференцировки МСК КМ, что проявлялось увеличением экспрессии мРНК ALP, Col-I и Runx2, а также увеличением активности ALP [70]. 

Исследователи предположили синергетическое влияние GSNO и экзосом на экспрессию провоспалительных цитокинов [70]. 

Результаты данного исследования показывают перспективность использования биоактивных агентов, таких как GSNO и экзосом, в сочетании со скаффолдами с целью улучшения регенерации костной ткани [70].

Восстановление крупных дефектов костной ткани зачастую ограничивается недостаточной васкуляризацией образующейся ткани [73]. Ангиогенез играет существенную роль в процессе ремоделирования костной ткани, соответственно, для эффективного заживления необходимо улучшение как остеогенеза, так и ангиогенеза [13]. В своем исследовании Y. Zha et al. [2] изучали бесклеточную систему тканевой инженерии с использованием инкапсулированного гена фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в составе экзосом на поверхности 3D-смодулированного из PCL скаффолда на модели дефекта лучевой кости у крыс. Микро-КТ-анализ через 6 и 12 недель выявил значительное улучшение регенерации костей в экспериментальной группе, а результаты гистологического анализа показали наличие более зрелых коллагеновых волокон по сравнению с контрольной группой [2].

 В ходе исследования продемонстрирована двойная роль экзосом-модифицированных скаффолдов: в качестве индуктора остеогенной дифференцировки МСК КМ и в качестве депо VEGF, обеспечивающего ремоделирование сосудистой сети [2]. Данная работа демонстрирует возможность использования экзосом и в качестве биовектора доставки биологически активных веществ для улучшения регенерации костной ткани [2].

Ранее было показано, что Exos МСК КМ (BMSC-Exos) и магнитные наночастицы (например, Fe3O4, y-Fe2O3) в сочетании со статическим магнитным полем (SMF) положительно влияют как на остео- так и на ангиогенез [74, 75]. 

В ходе своего исследования D. Wu et al. [1] оценили влияние модифицированных магнитными наночастицами экзосом (BMSC-Fe3O4-Exos) в сочетании с SMF на функциональные характеристики эндотелиальных клеток вены пуповины человека (HUVEC) и BMSC, а также восстановление кальварного дефекта на модели крыс. Исследователями продемонстрирован остеогенный эффект данной модификации экзосом в сочетании со статическим магнитным полем, который проявлялся улучшением минерализации костной ткани, повышением секреции ALP и экспрессии мРНК остеогенных маркеров (OPN, RUNX2, COL-1) [1]. При совместном культивировании с HUVEC

отмечены такие эффекты как ускорение миграции клеток, большее количество трубчато-подобных структур, увеличение экспрессии мРНК проангиогенных факторов (VEGF, ANG-1, HIF-1a), что подтверждает ангиогенный эффект BMSC-Fe3O4-Exos-SMF [1]. Микро-КТ-анализ продемонстрировал увеличение количества новообразованной кости и сосудов в экспериментальной группе, что подтверждается результатами других исследований [76-81]. 

Положительное влияние на остео- и ангиогенез объяснено увеличением концентрации miR-1260a и ее воздействием на транскрипцию определенных генов [1]. Так, в BMSC miR-1260a ингибирует экспрессию HDAC7 и тем самым уменьшает его супрессирующее действие на экспрессию OPN, RUNX2, OCN, ALP и COL-1, аналогичный механизм действия наблюдается в HUVEC, где miR-1260a ингибирует COL4A2, увеличивая, таким образом, секрецию VEGF, ANG-1 и HIF-1    ангиогенный эффект продемонстрирован в работе G.D. Lu et al. [14]. В исследовании показано, что miR-29a-3p путем посттранскрипционного ингибирования VASH-1, отрицательно влияющего на ангиогенез, способствовал улучшению пролиферации и миграции эндотелиальных клеток, а также отмечено увеличение количества остеокальцин-положительных остеобластов, минеральной плотности кости и объема трабекулярной кости по сравнению с группой контроля [14]. Результаты данного исследования демонстрируют терапевтический потенциал экзосом в восстановлении костных дефектов [1].

Восстановление крупных костных дефектов остается насущной проблемой для травматологов-ортопедов, в связи с чем ведется активный поиск методик повышения эффективности костной регенерации [1,4]. Большое количество исследований при этом сосредоточено на применении мезенхимальных стволовых клеток и экзосом в качестве стимуляторов остеогенеза. Анализ современной медицинской литературы позволяет сделать определенные выводы:

-    во всех изученных нами исследованиях продемонстрировано положительное влияние мезенхимальных стволовых клеток и экзосом на процесс ремоделирования костной ткани;

-    местное использование мезенхимальных стволовых клеток характеризуется более выраженным регенеративным эффектом по сравнению с системным введением [21, 23, 26, 28];

-    развивающиеся методики увеличения дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани в остеогенном направлении позволят в дальнейшем использовать альтернативные костному мозгу источники мультипотентных клеток и, соответственно, снизить травматичность процедуры, что особенно актуально в случае тяжелого состояния пациента [44];

-   для улучшения регенеративного потенциала мезенхимальных стволовых клеток необходимо учитывать эндокринный статус как донора, так и реципиента, а также проводить противовоспалительную терапию для создания оптимального микроокружения трансплантированных клеток [31-36];

-     экзосомы противовоспалительных фенотипов макрофагов оказывают положительное влияние на процесс восстановления костей [60, 65-69];

-     экзосомы мезенхимальных стволовых клеток оказывают противовоспалительный, ангиогенный и остеогенный эффект, что обеспечивает более эффективную регенерацию костной ткани [1, 2, 14, 55, 56, 70, 74, 75].

Несмотря на активное развитие медицины, клиническая потребность в эффективной регенерации костей по-прежнему остается на высоком уровне. Использование мезенхимальных стволовых клеток и бесклеточных регенеративных подходов продемонстрировало хорошие результаты в восстановлении дефектов костной ткани и является перспективным направлением. Для продуктивного применения мезенхимальных стволовых клеток и экзосом в восстановлении костных дефектов необходимо дальнейшее изучение механизмов действия, а также оценка эффективности и безопасности данных регенеративных методик в доклинических и клинических исследованиях.

1    Wu D, Chang X, Tian J, et al. Bone mesenchymal stem cells stimulation by magnetic nanoparticles and a static magnetic field: release of exosomal miR-1260a improves osteogenesis and angiogenesis. J Nanobiotechnology. 2021;19(1):209.

3.    Herberg S, McDermott AM, Dang PN, et al. Combinatorial morphogenetic and mechanical cues to mimic bone development for defect repair. Sci Adv. 2019;5(8):eaax2476. doi: 10.1126/sciadv.aax2476

4.    Shang F, Yu Y, Liu S, et al. Advancing application of mesenchymal stem cell-based bone tissue regeneration. Bioact Mater. 2020;6(3):666-683. doi: 10.1016/j.bioactmat.2020.08.014

5.    Lopes D, Martins-Cruz C, Oliveira MB, Mano JF. Bone physiology as inspiration for tissue regenerative therapies. Biomaterials. 2018;185:240-275. doi: 10.1016/j.biomaterials.2018.09.028

6.    Sui BD, Hu CH, Liu AO, et al. Stem cell-based bone regeneration in diseased microenvironments: Challenges and solutions. Biomaterials. 2019;196:18-30. doi: 10.1016/j.biomaterials.2017.10.046

7.    Liang B, Liang JM, Ding JN, et al. Dimethyloxaloylglycine-stimulated human bone marrow mesenchymal stem cell- derived exosomes enhance bone regeneration through angiogenesis by targeting the AKT/mTOR pathway. Stem Cell

Анастасия Игоревна Гребень - ординатор, младший научный сотрудник

Петр Серафимович Еремин - научный сотрудник

Елена Юрьевна Костромина - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Павел Александрович Марков - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник